《实用免疫细胞与核酸》 (三）非放射性探针的显示体系

1．AP显色体系

BCI –OH+NBT→紫色↓

ASO：等位基因特异的寡核苷酸，BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝，Pi：磷酸。

2．HRP显色体系

HRP + H2O2[HRP·H2O2]

ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]枣→ODA-N = ODA/棕色↓+HRP +H2O

ODA：邻-联茴香胺。

3．ABC显色体系

DNA –B+ SA – AP→DNa – B – SA或DNa – B +SA - BAP→DNa –B –SA –BAP

经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显色。这里SA为Streptavidin（链酶亲合素），BAP为生物素化的磷酸酶，B为生物素（biotin），ABC为Avidin – Biotin - Enzyme com－plex, 即亲合素- 生物素-酶复合物。

以上反应AP亦可用HRP代替。

表18-3曱核酸探针的标记分子

标记物性质标记分子标记方法杂交体的检测法放射性分子[α-32P]dNTPNT、PCR、RPI放射自显影或计数[γ-32P]dNTPTL放射自显影或计数125I碘化放射自显影或计数35SNT放射自显影或计数3HNT放射自显影或计数非放射性分子生物素Bio-11-dUTPNT、TL、PCR酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色光敏生物素600W 可见光照同上生物素化补骨脂素365nm紫外线照同上生物素酰-e-氨基乙酸化学合成法同上N-羟基丁二酰亚胺脂酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色生物素肼化学合成法酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色酶微过氧化物酶直接法或合成法直接底物显色或用酶标抗体+ 底物显色碱性磷酸酯酶直接法或合成法同上荧光素罗丹明和FITC合成法直接荧光显微镜观察或酶标抗体+ 底物显色化学发光标记物化学发光测量或自显影抗双链单抗酶标或荧光标记单抗化学法直接底物显色稀有金属Eu3－化学法时间分辨荧光重金属Ag化学法Hg化学法半抗原磺酸胞嘧啶化学法酶标单抗 + 底物显色地高辛RPL酶标抗体 + 底物显色

* ：NT：缺口平移； PCR：聚合酶链反应；RPL： 随机引物标记； TL：末端标记

4．非放射发光自显影若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生光子的化合物，可用自显影技术暴光X线片显示。

（1）HRP发光自显影：氨基苯-甲酰肼在HRP与H2O2的作用下氧化为氨基苯二甲酸，同时放出N2及发光（波长428nm）。发光时加入某些酚的衍生物时可增强发光上千倍。反应如下图：

（2）AP的发光自显影：AP的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPPD），它含有磷酸酯键在AP的作用下水解下一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片（621型）直接暴光显影。显影信号强度比BCIP/NBP显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。

其发光反应的原理如下：

HRP的发光原理：

AP的发光原理：